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Entwicklung einer innovativen Methodik zur Bestimmung von 6

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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 14172 (2023) Diesen Artikel zitieren

3 Altmetrisch

Details zu den Metriken

6-Thioguanin ist ein Immunsuppressivum, ein Analogon von Guanin, das zur Behandlung von akuter Leukämie und entzündlichen Darmerkrankungen eingesetzt wird. Eine übermäßige Anwendung von 6-Thioguanin während der klinischen Behandlung kann Nebenwirkungen verursachen. Darüber hinaus ist eine zu niedrige Dosis wirkungslos. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem schnellen, selektiven und routinemäßigen Ansatz zur Quantifizierung von 6-Thioguanin in Körperflüssigkeiten, um eine klinische Anwendung zu unterstützen. Es wurde eine vollständig validierte HPLC-Methode zur Bestimmung von 6-Thioguanin in Vollblutproben unter Verwendung von 5-Bromuracil als internem Standard entwickelt. 6-Thioguanin-Nukleotide wurden durch Perchlorsäure aus Erythrozyten freigesetzt und dann bei 100 °C zum ursprünglichen Thiopurin, 6-Thioguanin, hydrolysiert. Folgende Validierungsparameter der Methode wurden ermittelt: Spezifität/Selektivität, Linearitätsbereich (479–17.118 ng/ml, R > 0,992), Nachweisgrenzen (150 ng/ml) und Quantifizierung (479 ng/ml), Genauigkeit (−). 5,6 < Bias < 14,7), Wiederholbarkeit (CV 1,30–3,24 %), mittlere Präzision (CV 4,19–5,78 %), Extraktionsausbeute (79,1–103,6 %) und Verschleppung. Darüber hinaus wurde die Stabilität des Arzneimittels in Vollblutproben unter verschiedenen Lagerungsbedingungen untersucht. Die vorgeschlagene Methode eignet sich zur Bestimmung von 6-Thioguanin in Vollblut-Erythrozytenproben zur Überwachung des Arzneimittelspiegels und damit zur korrekten Dosierung.

6-Thioguanin (6-TG) ist ein Purinanalogon von Guanin; genauer gesagt handelt es sich um ein Schwefelderivat von Guanin1. 6-TG gehörte zur Familie der Thiopurine und wurde 1950 zur Behandlung von Leukämie eingeführt. Fünfzig Jahre später begannen Kliniker damit, es zur Behandlung entzündlicher Darmerkrankungen einzusetzen, und zwar bei Patienten, die aufgrund dosislimitierender unerwünschter Ereignisse oder einer suboptimalen Reaktion kein Azathioprin (AZA) oder Mercaptopurin (MP) erhalten hatten2, 3. Allerdings gab es Bedenken hinsichtlich des Hepatotoxizitätsprofils wird durch die weit verbreitete Anwendung, insbesondere die noduläre regenerative Hyperplasie (NRH), behindert4. 6-TG wird auch in der klinischen Behandlung des erworbenen Immundefizienzsyndroms, von Autoimmunerkrankungen wie Psoriasis und bei der Chemotherapie bei akuten Leukämien, insbesondere akuter myeloischer Leukämie und akuter lymphoblastischer Leukämie, eingesetzt5, 6. Das mit 6-TG verbundene zusätzliche Risiko kann die Entwicklung von Lymphom und Hautkrebs, wie im Fall von AZA/MP- und Anti-TNF-Therapien gezeigt7, 8. Daher ist es wichtig, den 6-TG-Spiegel regelmäßig zu überprüfen, um die richtige Dosis des Arzneimittels zu bestätigen oder im Falle einer abnormalen Erkrankung Ergebnisse, um die Dosis anzupassen. Thiopurine, einschließlich 6-TG, haben eine immunsuppressive Wirkung, indem sie ihre pharmakologisch aktiven Metaboliten, 6-Thioguanin-Nukleotide (6-TGN), in Nukleinsäuren einbauen9. Dies führt folglich zu einer Hemmung der Lymphozytenproliferation, einschließlich ihrer bedeutenden Rolle bei der Auslösung der Apoptose10. Obwohl die Mechanismen, die die Resistenz leukämischer Zellen gegenüber 6-Thioguanin verursachen, derzeit missverstanden werden11, wurde vermutet, dass eine Verringerung oder Abwesenheit der Aktivität der Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPT) zusammen mit einer veränderten Aktivität der Thiopurin-S-Methyltransferase (TPMT) die Empfindlichkeit und Resistenz dagegen stimuliert Verbindungen12. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Defekte im DNA-Mismatch-Reparatursystem die erworbene Resistenz gegen zahlreiche Arzneimittel gegen Krebs, einschließlich 6-Thioguanin, stimulieren13. Die Messung der 6-TG-Erythrozyten-Metabolitenspiegel hilft bei der Bestimmung der Angemessenheit der AZA-Dosierung und kann zur Optimierung der Dosis der Antimetaboliten-Therapie verwendet werden, um ein verbessertes klinisches Ansprechen zu erreichen, ohne Leukopenie auszulösen14. Die Kombination von Infliximab und Thiopurinen (wie 6-Thioguanin) ist bei Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen wirksamer als eine Monotherapie. Die Messung der TPMT-Aktivität wird vor Beginn der Behandlung von Patienten mit Thiopurin-Medikamenten wie 6-Thioguanin empfohlen, um eine Anpassung der Thiopurin-Dosis oder einen vollständigen Verzicht auf das Medikament zu ermöglichen15. Bei vielen ethnischen Gruppen führen TPMT-Polymorphismen zu einer verminderten (10 % Prävalenz) oder fehlenden (0,3 %) TPMT-Aktivität16. Personen, die homozygot oder heterozygot für diese Art genetischer Variation sind, können erhöhte Werte an TGN-Metaboliten aufweisen, was das Risiko einer arzneimittelinduzierten Knochenmarktoxizität aufgrund der Anreicherung des nicht metabolisierten Arzneimittels erhöht17. 6-TGN-Werte über 230 pmol/8 × 108 Erythrozyten wurden mit verbesserten Ergebnissen bei Patienten unter Monotherapie in Verbindung gebracht. Ein 6-Thioguanin-Spiegel von 125 pmol/8 × 108 Erythrozyten oder mehr kann ausreichend sein, um therapeutische Infliximab-Spiegel zu erreichen18. Im Allgemeinen werden 6-TGN-Werte von mehr als 235 pmol/8 × 108 Erythrozyten als therapeutischer Grenzwert für Patienten unter AZA oder 6-MP19 empfohlen. Ein sicherer und therapeutischer Wert liegt zwischen 500 und 800 pmol/8 × 108 Erythrozyten20. Für die 6-TG-Therapie bei Patienten mit IBD wurden bisher keine genauen therapeutischen oder toxischen 6-TGN-Spiegel beschrieben. Hepatotoxizität, insbesondere noduläre regenerative Hyperplasie (NRH) und venookklusive Erkrankung (VOD), ist jedoch dosisabhängig und steht im Zusammenhang mit 6-TGN-Spiegeln über 1000 pmol/8 × 108 Erythrozyten21. Übermäßiger Gebrauch von 6-TG während der klinischen Behandlung kann extratoxische Nebenwirkungen haben6. Darüber hinaus ist eine Unterdosierung wirkungslos. Daher ist ein schneller und vollständig validierter Ansatz zur quantitativen Bestimmung von 6-TG in Körperflüssigkeiten für die klinische Anwendung von entscheidender Bedeutung. Derzeit sind Immunoassays und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) weit verbreitete, praktische und empfindliche Techniken in der therapeutischen Arzneimittelüberwachung22, 23.

Bisher wurden mehrere analytische Ansätze zur Bestimmung von Thiopurin-Metaboliten unter Verwendung von UPLC-MS/MS24 und LC-MS/MS25,26,27 beschrieben. Die definierten Methoden variieren in der biologischen Matrix, dem Probenvorbereitungsverfahren und der chemischen Form der Analyten. Allerdings kann keines der oben erlaubten 6-TGs direkt aus roten Blutkörperchen durch HPLC allein quantifiziert werden. Zahlreiche Labore weltweit beobachten die Metaboliten von Thiopurin, um die Behandlung individuell anzupassen. 6-TG wird derzeit in roten Blutkörperchen11 und Vollblut28 gemessen. Die Leukozyten-6-TG-Spiegel lagen zwischen 100 und 2305 pmol/mg DNA, während die Erythrozyten-6-TG-Spiegel zwischen 64 und 1038 pmol/8 × 10(8) Erythrozyten lagen; Die 6T-G-Spiegel der Leukozyten-DNA korrelierten direkt mit den 6-TG-Spiegeln der Erythrozyten29. Die meisten Wirkungen von Thiopurin, wie der DNA-Einbau und die Immunsuppression, treten eher in weißen Blutkörperchen als in roten Blutkörperchen auf. Diese Zellen sind jedoch reichlich vorhanden und lassen sich mühelos trennen, was sie zu einer rationalen Alternativmatrix macht30.

Ziel unserer Arbeit war die Entwicklung einer vollständig validierten HPLC-Methode zur schnellen und selektiven quantitativen Bestimmung von 6-TG in Vollblut-Erythrozyten für diagnostische Zwecke. Die Methode wurde streng validiert. Darüber hinaus wurden spezifische Validierungsparameter und klinische Bewertungen ermittelt und gezeigt, dass die Methode zur routinemäßigen Bestimmung von 6-TG bei Patienten geeignet ist. Unser Ziel war es, überhaupt eine Routinemethode zu entwickeln, damit jedes Labor den gesamten Vorgang für klinische Studien wiederholen kann. Nach unserem Kenntnisstand handelt es sich bei diesem Artikel um die einzige einfache, kostengünstige, empfindliche, gut charakterisierte, robuste und vollständig validierte HPLC-Methode zur Überwachung von 6-TG im Vollblut.

Die HPLC-Methode wurde für die Bestimmung von 6-Thioguanin (6-TG) in Vollblutproben mit roten Blutkörperchen (RBCs) unter Verwendung von 5-Bromuracil (5-BU) als internem Standard (IS) entwickelt. Es wurde eine mobile Phase bestehend aus ACN/Puffer KH2PO4 (3/97, v/v) mit 50 µl H3PO4 im isokratischen Fluss verwendet. 6-TG wurde bei einer Wellenlänge von 341 nm und 6-BU bei 280 nm nachgewiesen. Unter den chromatographischen Bedingungen wurden sowohl die Verbindungen als auch der biologische Hintergrund gut getrennt. Eine einfache und schnelle Methode zur Freisetzung von 6-Thioguanin-Nukleotiden aus Erythrozyten durch Perchlorsäure und anschließende Hydrolyse (100 °C) zum Ausgangsstoff Thiopurin (6-TG) wurde zur Herstellung der Proben verwendet und anschließend zur Hydrolyse (100 °C) zum Ausgangsstoff Thiopurin (6-TG). Durch die Umrechnung des freigesetzten 6-TG-Gehalts in 6-TGN kann die in den Erythrozyten vorhandene Menge an 6-TGN bestimmt werden. Die Methode wurde gemäß EMA22, ICH23 und ISO 1702524 vollständig validiert. Solche analytischen Parameter werden als Spezifität, Selektivität, Linearitätsbereich, Extraktionsausbeute und Wiederholbarkeit, Präzision (Intraday- und Intraday-Präzision), Genauigkeit, LOD und LOQ beschrieben .

Die Methode erwies sich unter den angenommenen Versuchsbedingungen als spezifisch. Ein Vergleich des Chromatogramms der Probe der wässrigen Lösung des 6-Thioguanin-Standards und des internen Standards (Abb. 1) zeigt das Fehlen der Peaks der Substanzen, die während der Retention des internen Standards bzw. des internen Standards eluieren Beibehaltung der Analytstandards. Ebenso zeigt ein Vergleich des Chromatogramms, das die Trennung der Probe ohne Analyten zeigt, und dem IS (Abb. 2), dass keine Substanzpeaks vorhanden sind, die das Ergebnis der Bestimmung der Testsubstanz negativ beeinflussen könnten.

Chromatogramme einer wässrigen Lösung von 6-TG und IS.

Chromatogramme einer Probe ohne 6-TG und IS.

Das Spektrum von 6-TG und dem internen Standard aus Proben mit roten Blutkörperchen ist in Abb. 3 dargestellt. Die Reinheit der Peaks der Substanz in den mit 6-TG und IS angereicherten Proben wurde auf der Grundlage des Absorptionsspektrums der getesteten Verbindung und des internen Standards analysiert. Die Ergebnisse dieser Testreihe sind in Abb. 4 dargestellt. Der erhaltene maximale Reinheitsindex (PPI, ausgedrückt in [%]) für 6-TG beträgt 99,9 % und für den internen Standard 99,9 %. Die PPI-Werte (Kriterium: PPI > 95 %) belegen die hohe Spezifität der Methode.

Standardspektren: (a) 6-Thioguanin in der Testprobe bei 2000 ng/ml, (b) interner Standard im Serum.

Spektrale Reinheit des Peaks: (a) 6-Thioguanin bei 2000 ng/ml, (b) interner Standard (Mittelwert der Peakreinheit 0,999 – Peak rein).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Fehlen von Peaks von Substanzen, die bei und um die Retentionszeiten der Testsubstanzen (6-TG) und des internen Standards (6-BU) in den Hilfsstoffen eluieren, die genaue Spezifität der Bestimmung beider Testverbindungen beweist. Die Gültigkeit dieser Schlussfolgerung wird durch die im Abschnitt über die Überprüfung der Selektivität der Methode und die Analyse des Verhältnisses der bei der Retention von Analyten und des internen Standards in den Blindproben verschiedener Proben erhaltenen Signale zu den charakterisierenden Daten bestätigt Mit 6-TG angereicherte Probe auf LLOQ-Niveau (untere Quantifizierungsgrenze).

Gemäß den Richtlinien wird die Abwesenheit störender Substanzen durch den Vergleich der während der Analytretentionszeit erhaltenen Signale und des internen Standards für die Blindprobe und die Probe auf LLOQ-Ebene bestimmt (Abb. 5, 6). Die Detektorreaktion während der Analytretention für die Blindprobe sollte weniger als 20 % des in der LLOQ-Probe gefundenen Signals und weniger als 5 % des Signals während der IS-Retention betragen. In diesem Fall beträgt sie 0 % für 6-TG bzw. 0 % für IS. Somit weist das validierte Verfahren eine gute Selektivität auf. Darüber hinaus bestätigt die Analyse der Peaks der Retentionszeiten der störenden Substanzen in allen getesteten Blindproben einen hohen Grad ihrer Trennung von den Peaks beider Analyten und IS (Auflösung RS > 2). Das Akzeptanzkriterium wurde erfüllt.

Chromatogramme einer Blindprobe.

Chromatogramme von mit 6-TG angereicherten Erythrozytenproben bei der niedrigen Kontrollkonzentration.

Die Analyse der Linearität der 6-Thioguanin-Chromatographiemethode wurde an Blut durchgeführt, das mit Testsubstanzen in dem Bereich angereichert war, der das therapeutische Niveau der 6-TG-Konzentration abdeckt (100–450 pmol/8 × 108 Erythrozyten). Allerdings schwanken die 6-Thioguanin-Werte stark, und der Bereich der Methode wurde von 479 auf 17.118 ng/ml (48 pmol/8 × 108 Erythrozyten bzw. 1650 pmol/8 × 108 Erythrozyten) erweitert und validiert. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Arbeitskalibrierlösungen aus dem 6-TG-Standard in einer Konzentration von 10 mg/mL unter Zugabe einer genau bekannten und gleichen Menge des internen Standards (IS-Standard in einer Lösung von 100 µg/mL) analysiert. ml). Für jede Konzentrationsstufe wurden unabhängig voneinander vier Kalibrierlösungen hergestellt und auf das chromatographische System dosiert. Um die Präzision der Berechnung der 6-TG-Konzentration anhand der Gleichungen der Kalibrierungskurven zu überprüfen (berechnet auf der Grundlage der Durchschnittswerte der 6-TG- und internen Standardoberflächen), sind die Ergebnisse in Tabelle 1 zusammengefasst Im Vergleich werden die „experimentellen“ Konzentrationen der zur Kalibrierung verwendeten Kalibrierlösungen für chromatographische Systeme (C6-TGEXP und C6-TGCAL) dargestellt. Darüber hinaus enthalten die Tabellen Konzentrationsdifferenz (SC), Messfehler (Bias) und CV.

Aus den oben dargestellten Daten geht hervor, dass der Bias für die Kalibrierungslösungen 1 bis 6 im Bereich von − 16,3 < Bias < 10,1 (für 6-TG) liegt. In Anbetracht dessen, dass das Kriterium für die Akzeptanz von Kalibrierlösungen darin besteht, eine anhand der Gleichung der Kalibrierkurve berechnete Konzentration zu erhalten, die nicht um mehr als 15 % von der Nennkonzentration abweicht (im Fall des LLOQ-Niveaus sollte die geschätzte Konzentration 20 % nicht überschreiten) der Nennkonzentration) bestätigen die erhaltenen Ergebnisse die Erfüllung des Akzeptanzkriteriums für die getestete Verbindung.

Basierend auf den im Abschnitt „Materialien und Methoden“ erwähnten mathematischen Beziehungen betrugen die LOD- (Abb. 7) und LOQ-Werte (Abb. 8) für 6-TG 371 ng/ml bzw. 1123 ng/ml. Nach Erhalt der Berechnungsergebnisse wurde jedoch überprüft, dass das EP s/n (Signal-Rausch-Verhältnis) für die Konzentrationen 371 ng/ml bzw. 1123 ng/ml viel höher ist als die angenommenen Anforderungen; Es wurde beschlossen, eine Konzentration zu finden, die diesen Anforderungen gerecht wird. LOD von 150 ng/ml (entspricht 14 pmol/8*108 RBC) und EP s/n = 8 und LOQ von 479 ng/ml (entspricht 46 pmol/8*108 RBC), wobei EP s/n = 21. Die Ergebnisse bestätigen die Erfüllung des Akzeptanzkriteriums für die getestete Verbindung.

Chromatogramme der 6-TG (150 ng/ml) Kalibrierungslösung (LOD) (7,6 Min. – 6-TG; 10,0 Min. – IS).

Chromatogramme der 6-TG (479 ng/ml) Kalibrierungslösung (LOQ).

Die Genauigkeit der 6-TG-Analyse wurde durch dreifache Analyse von fünf verschiedenen Vollblutproben bewertet, die mit der Testsubstanz in drei Konzentrationsstufen angereichert waren, die den kalibrierten Konzentrationsbereich abdeckten, d. h. 750 ng/ml; 4389 ng/ml, 12.540 ng/ml (entspricht 73 pmol/8*108 RBC; 423 pmol/8*108 RBC, 1209 pmol/8*108 RBC). Der Bias für 6-TG liegt im Bereich von − 5,6 < Bias < 14,7. Dies bedeutet, dass der Durchschnittswert der Ergebnisse nicht um > 15 % von den Nominalwerten abweicht. Es besteht kein statistischer Unterschied zwischen den mittleren Konzentrationen der für die Konzentrationsstufe berechneten Ergebnisse und dem bekannten Konzentrationswert. Das Akzeptanzkriterium für beide Verbindungen wurde erfüllt.

Basierend auf den ermittelten Verhältnissen der 6-TG-Peakfläche zum internen Standard und der Gleichung der Kalibrierkurven wurden Konzentrationen von Analyten ermittelt, deren Mittelwerte zusammen mit der statistischen Aufbereitung der erhaltenen Ergebnisse in Tabelle 2 zusammengefasst sind . Die Analyse der Ergebnisse aus den obigen Tabellen zeigt, dass die Wiederholbarkeit der 6-TG-Analyse bei drei Analytkonzentrationsniveaus (750 ng/ml, 4.389 ng/ml und 12.450 ng/ml) ausgedrückt durch den Wert des Variationskoeffizienten ist (CV) liegt im Bereich von 1,30–3,24 %. Somit ist das Akzeptanzkriterium erfüllt.

Die mittlere Präzision der Analyse von 6-TG im Vollblut bei drei Konzentrationsniveaus, ausgedrückt als Variationskoeffizient (CV), liegt für 6-TG im Bereich von 4,19–5,78 %. Die Untersuchung wurde von verschiedenen Analysten unter Verwendung unterschiedlicher Standardarbeitslösungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die erhaltenen Werte für den Variationskoeffizienten erfüllen das Akzeptanzkriterium.

Die Oberflächen der Analyten und des internen Standards, die für fünf verschiedene EDTA-Blutproben erhalten wurden, die mit 6-TG und IS in drei Konzentrationsstufen (750 ng/ml; 4389 ng/ml, 12.540 ng/ml) versetzt wurden, werden zusammen mit den berechneten Wiederfindungen dargestellt für jede Ebene in Tabelle 4.

Der Vergleich der Durchschnittswerte der 6-TG- und IS-Wiederfindung, die bei einzelnen Konzentrationsniveaus beider Analyten erhalten wurden, zeigt, dass sie für alle Verbindungen vergleichbar und unabhängig von der Konzentration des Analyten ist. Die durchschnittliche Rückgewinnung von 6-TG, berechnet für drei Konzentrationsniveaus dieser Verbindung, beträgt jeweils 79,1–103,6 %. Das Akzeptanzkriterium wurde erfüllt.

Die während der Retentionszeit des Analyten abgelesenen Signale und der IS in der Blindprobe, die nach der Kalibrierungslösung mit der höchsten Konzentrationsstufe dosiert wurde, wurden gesammelt. Die Analyse der Ergebnisse ergab das Fehlen von Peaks im Chromatogramm, das der Blindprobe entsprach. Unmittelbar nach der Dosierung wurde die Kalibrierlösung mit der höchsten Analytkonzentration dosiert. Es beweist das Ausbleiben einer Probenübertragung und bestätigt damit, dass das Akzeptanzkriterium erfüllt ist.

Stammlösungen sind 30 Tage lang stabil. Standard zur Kalibrierung und Kontrolle – Vollblutproben, die mit 6-TG bei niedrigen (650 ng/ml) und hohen (8906 ng/ml) IS-Werten versetzt waren, wurden für Stabilitätsprüfungen verwendet und 24 Stunden lang in einem Autosampler bei 5 °C gelagert. Die Entscheidung, für die Stabilitätsbewertung Konzentrationen von 650 ng/ml und 8906 ng/ml zu verwenden, basierte auf mehreren Überlegungen. Erstens liegen diese Konzentrationen im linearen Bereich der zur Bewertung verwendeten Analysemethode. Es ist wichtig, die Stabilität bei Konzentrationen innerhalb dieses Bereichs zu beurteilen, um bei Routineanalysen genaue und zuverlässige Ergebnisse sicherzustellen. Zweitens wurde die Entscheidung, die Stabilität bei diesen spezifischen Konzentrationen zu bewerten, durch die Beobachtung solcher Konzentrationen in Proben mehrerer Patienten beeinflusst. In der klinischen Praxis kommt es nicht selten vor, dass in Patientenproben unterschiedliche Analytkonzentrationen auftreten. Daher liefert die Bewertung der Stabilität bei Konzentrationen, die üblicherweise in realen Proben vorkommen, wertvolle Informationen über die Leistung des Assays unter realistischen Bedingungen. Die für die 6-TG- und IS-Peaks erhaltene Detektorreaktion wurde in der Probe verglichen, die dem verifizierten Parameter ausgesetzt war. Als Akzeptanzkriterium für die getesteten Lösungen wurde die Wiederfindung [%] gegenüber der frisch zubereiteten Lösung im oben angegebenen Bereich bei den Wiederfindungstests übernommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 als Wert der unabhängig hergestellten Proben dargestellt. Die Analyse der vorgelegten Daten zeigt, dass: (a) Proben des internen Standards sowie Proben von Basis- und Arbeitsstandards nicht eingefroren werden sollten; In den getesteten Proben wurden ausgefällte Substanzen beobachtet, die sich nach Stehenlassen bei Raumtemperatur sowie nach Verwendung des Vortex nicht auflösten. und (b) die mit niedrigem und hohem EDTA-Gehalt angereicherte Vollblutprobe ist sehr stabil. Bei Lagerung in einem Autosampler-Feeder (5 °C) ist es bis zu 24 Stunden stabil. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass mit zwei 6-TG-Konzentrationen angereicherte Vollblutproben bis zu 24 Stunden bei 5 °C stabil sind. Patientenproben wurden 10 Tage lang getestet, wobei tägliche Tests durchgeführt wurden (Proben wurden bei Raumtemperatur im Kühlschrank gelagert). und gefroren). Die Analyse ergab, dass die Proben nicht eingefroren werden konnten (Rückgewinnung unter 50 %). Bei Proben, die 2 Tage bei Raumtemperatur gelagert wurden, lag die Wiederfindung bei über 50 % (bei Proben, die länger als 2 Tage gelagert wurden). Proben, die 7 Tage lang im Kühlschrank gelagert wurden, zeigten eine angemessene Erholung. Bewertet wurde die Stabilität der Forschungsstandards (30 Tage – Gefrierschrank) und die Stabilität der vorbereiteten Testproben für die Analyse innerhalb von 24 Stunden. Die Studie ermöglichte die Bestimmung der Stabilität der getesteten Probe (7 Tage bei Raumtemperatur).

Bevor wir die in diesem Artikel beschriebene Methode zur schnellen und empfindlichen Bestimmung von 6-TG in roten Blutkörperchen entwickelten, haben wir viele Forschungsprotokolle in wissenschaftlichen Artikeln zur Probenvorbereitung, zum Wissen über Probenstabilität und zu Analysemethoden getestet. Es wurden modifizierte, validierte Methoden aus all diesen Artikeln verwendet, um unseren Ansatz anzupassen und zu erweitern. Diese Studien haben uns inspiriert und uns ein umfassendes Bild der Methodenoptimierung vermittelt.

Die entwickelte Analysemethode ist schneller als die in der Arbeit von Cangemi et al.31 enthaltene Methode. Die Gesamtzeit des Tests beträgt etwa 40 Minuten und ermöglicht die Verwendung eines kleineren Probenvolumens, das in die Chromatographiesäule injiziert wird, was wiederum zu einer Verlängerung führen kann die Lebensdauer der Säule, was zu Einsparungen bei der routinemäßigen Wartung führt.

Im Vergleich zur Veröffentlichung von Franzin et al.32 ermöglicht unsere Methode ein breiteres Spektrum getesteter Proben, niedrigere Nachweisgrenzen (LOD) und Quantifizierungsgrenzen (LOQ) sowie die Möglichkeit, 6-TG mit einer Auflösung von mehr als zu bestimmen 2,0.

Stefan et al.33 konzentrierten sich in verschiedenen Studiengruppen auf verschiedene Aspekte der Probenstabilität und des Referenzbereichs; Unser Ansatz minimierte die Anzahl der in Testproben verwendeten Chemikalien und führte zu Bemühungen zur Reduzierung der Probenvolumina. Dies war ein wichtiges Ziel, insbesondere für Proben von Kindern, die entsprechende Medikamente erhielten. Unter der Annahme, dass in unserer Studie 200 µL verwendet werden, ist es möglich, von kleinen Patienten eine winzige Probe zu entnehmen.

Heutzutage, wo die Möglichkeit einer einfachen und relativ schnellen Analyse eine wichtige Rolle spielt, insbesondere wenn Arzneimittelkonzentrationen in einer großen Patientengruppe vorliegen, ist es von entscheidender Bedeutung, dass Validierungsarbeiten durchgeführt werden, um das erforderliche Probenvolumen weiter zu reduzieren.

Ziel der Forschung war die Entwicklung und Validierung einer schnellen und empfindlichen HPLC-basierten Methode zur Bestimmung von 6-TG in roten Blutkörperchen. Die untere Bestimmungsgrenze (LLOQ) lag bei 450 ng/ml und die obere Bestimmungsgrenze (ULOQ) bei 17.000 ng/ml 6-TG im Vollblut. Die berechneten LOD- und LOQ-Werte betrugen 150 bzw. 479 ng/ml Vollblut. Die Kalibrierungskurve war linear (R > 0,99) über den 6-TG-Konzentrationsbereich von 479–17.118 ng/ml im Vollblut. Die Intra-Day- und Inter-Day-Präzision lag innerhalb allgemein anerkannter Kriterien für eine bioanalytische Methode (< 15 %).

Die Methodik hilft bei der Beurteilung der Therapiequalität durch die Bestimmung der Konzentration von 6-Thioguanin. Die Methode berücksichtigt im Endergebnis der Testprobe den Gehalt an roten Blutkörperchen (RBC) bei jedem Patienten. Die Konzentrationen der Metaboliten können erheblich variieren. Die Ergebnisse zeigen, dass während der Behandlung mit diesem Arzneimittel manchmal niedrige Konzentrationen von 6-Thioguanin über einen langen Zeitraum aufrechterhalten werden. Die Methode ermöglicht die Bestimmung eines breiten Konzentrationsbereichs, was zu einer großen Vielfalt und bemerkenswerten Möglichkeiten dieser Methode führt.

Die entwickelte Methode ist einfach, schnell, effektiv und zuverlässig. Es eignet sich zur Analyse dieses Antileukämie-Medikaments über einen weiten therapeutischen Konzentrationsbereich im Vollblut. Seine Nützlichkeit wurde durch die Anwendung bei der Analyse tatsächlicher, mit 6-TG angereicherter Blutproben nachgewiesen. Daher eignet sich die vorgeschlagene Methode zur Bestimmung von 6-TG im Vollblut zur Überwachung des Arzneimittelspiegels und für pharmakokinetische Studien.

5-Bromuracil (5-BU), das als interner Standard (IS) verwendet wurde, wurde von Sigma-Aldrich geliefert (LOT 852473, 98 % Reinheit). 6-Thioguanin (6-TG) wurde als Stammlösung von LGC Standards geliefert (LOT MM0865.0, 99 % Reinheit). Acetonitril (ACN) und Orthophosphorsäure 85 %, beide HPLC-Qualität, wurden von VWR gekauft (LOT 83640 und 15315). Perchlorsäure (70 %) wurde von Merck bezogen (LOT 30755-M). Es wurde entionisiertes Wasser von Milli-Q (Millipore) verwendet (LOT 83645). Zur Validierung der Methode wurden rote Blutkörperchen (RBCs) verwendet. Im Rahmen routinemäßiger Arzneimittelüberwachungsuntersuchungen wurden Vollblutproben von Patienten untersucht, denen 6-Thioguanin verabreicht wurde.

Eine Stammlösung von 6-TG (Cp 6-TG) mit einer Konzentration von 6 mg/ml in 0,1 M NaOH. Um eine Arbeitslösung von 6-TG (Cr 6-TG) herzustellen, wurden geeignete Verdünnungen im Linearitätsbereich von 50 ng/ml bis 2000 ng/ml hergestellt. Als Verdünnungslösungsmittel wurde Wasser verwendet. Ein interner Standard von 5-Bromuracil (Cr IS) in einer Konzentration von 1 mg/ml in 5 ml 0,1 M NaOH. Standards und interne Standards wurden bei 2–8 °C gelagert.

Vollblut wurde gesunden Freiwilligen entnommen und in Röhrchen mit Natriumheparin gesammelt. Für die Blutentnahme wurden vorzugsweise Ellenbogen- oder Kopfvenen verwendet. Für 1 ml Vollblut wurde 1 ml Kochsalzlösung zugegeben und dann 5–10 Minuten bei 4 °C und 5000 U/min zentrifugiert; das resultierende Plasma wurde verworfen. Besonderes Augenmerk wurde darauf gelegt, die Schicht der weißen Blutkörperchen über den Erythrozyten nicht zu stören. Die Zentrifugation wurde zweimal wiederholt, um das Plasma zu entfernen und nur rote Blutkörperchen übrig zu lassen.

Aus dem 6-Thioguanin-Standard in einer Konzentration von 0,05 mg/ml (Cr 6-TG) wurde eine Reihe von Arbeitskalibrierlösungen unter Zugabe einer genau bekannten und gleichen Menge des internen Standards (IS-Standardkonzentration in einer Lösung von) erhalten 1 mg/ml) und rote Blutkörperchen ohne Studiensubstanzen und internen Standard. Die zur Kalibrierung hinzugefügten roten Blutkörperchen dienen als Vorlage, um die Bedingungen von Blutproben besser nachzubilden. Dies beeinflusst die Löslichkeit und Wechselwirkung der Analyse mit anderen Blutbestandteilen, was für die Kalibrierung der Analysemethode wesentlich ist. In diesem Fall wurden rote Blutkörperchen als Matrixelement hinzugefügt, um die Proben an realistischere Laborbedingungen anzupassen. Die zur Herstellung der Arbeitskalibrierungslösungen verwendeten Volumenverhältnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst.

Kontrollproben wurden in Vollblut, das weder Studiensubstanzen noch internen Standard enthielt, durch Anreicherung mit 6-TG-Standardlösungen in einer Konzentration von 0,05 ng/ml (Cr 6-TG) unter Zugabe einer genau bekannten und gleichen Menge des internen Standards hergestellt Konzentration (Konzentration des IS-Standards in einer Lösung von 1 mg/ml). Die zur Herstellung der Kontrollproben verwendeten Volumenverhältnisse sind in Tabelle 7 zusammengefasst.

Pipettieren Sie genau 200 µl Vollblut, 140 µl Kochsalzlösung (für Kalibrierungs- und Kontrollproben die entsprechende Menge Arbeitslösung und eine entsprechend geringere Menge Kochsalzlösung hinzufügen), 10 µl interne Standardlösung (Cr IS), 25 µl DTT (Ditriethiol – 1,1 M Lösung) und 50 µl Perchlorsäure (65 %) in einem Eppendorf-Röhrchen. Der Röhrcheninhalt wurde gründlich mit einem Vortex gemischt (30 s) und zentrifugiert (12.500 U/min, 10 min). Der Überstand wurde dann zu Eppendorf überführt und 40 Minuten lang auf 100 °C erhitzt. Nach dieser Zeit wurde die Probe abgekühlt und auf die HPLC-Platte übertragen. Der Fläschcheninhalt wurde mit einem Schüttler gründlich gemischt (10 s) und dann in ein Fläschchen des Autosampler-Feeders gegeben. Unbedingt sicherstellen, dass die Flüssigkeit im Einsatz keine Luftblasen enthält.

Alle Analysen wurden mit dem Flüssigkeitschromatographiesystem Modell Nexera Array-Detektor (PDA). Die Daten wurden mit der LabSolutions-Software erfasst und verarbeitet.

Die Trennungen wurden unter Verwendung einer analytischen Säule Luna™, Phenomenex (250 × 4,6 mm, 5 μm) durchgeführt. Eine mobile Phase bestehend aus 6,8 g ACN/Puffer KH2PO4 wurde in 1 l 3/97 % v/v unter Zusatz von 50 ul H3PO4 bei einer konstanten Flussrate von 1,0 ml/min verwendet. Die stationäre Phase war Acetonitril. Die Säule wurde bei Wellenlängen von 30 °C gehalten und die Eluenten wurden bei 280 nm (5-BU-Analyse) und 341 nm (6-TG-Analyse) überwacht. Das Injektionsvolumen betrug 50 µl.

Die Methodenvalidierung wurde gemäß den Richtlinien EMA34, ICH35 und ISO 1702536 in Bezug auf Selektivität/Spezifität, Linearitätsbereich, Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen, Genauigkeit, Präzision, Extraktionsausbeute, Verschleppung und Stabilität durchgeführt.

Eine bestimmte/spezifische Analysemethode sollte die Auflösung und den Nachweis des interessierenden Arzneimittels sowie den internen Standard für das Auftreten potenziell gleichzeitig verabreichter Arzneimittel und koeluierender endogener Verbindungen in der Matrix ermöglichen37.

Die Spezifität der Bestimmung der 6-Thioguanin-Methode wurde durch Analyse von Serumproben ohne Testsubstanzen und internem Standard (negativer Test) und der Auflösung zwischen den Peaks wässriger Lösungen von Testsubstanzstandards (positiver Test) und wässrigen Lösungen des internen Standards bewertet Standard (positiver Test) sowie zwischen diesen Peaks und Vollblutproben mit Zusatz von Testsubstanzen (mit 6-Thioguanin angereicherte Proben) und mit einem internen Standard angereicherte Serumproben.

Um die Selektivität der Methode zu überprüfen, wurden fünf Blindproben verschiedener Patienten analysiert. In jedem Chromatogramm wurden die während der Retentionszeit von 6-TG und IS erhaltenen Signale integriert und mit denen verglichen, die in der Probe erhalten wurden, die mit dem Testsubstanzgehalt am LLOQ (untere Bestimmungsgrenze) angereichert war.

Die Linearität einer Analysemethode bedeutet die direkte proportionale Reaktion der erhaltenen Ergebnisse auf die Analytkonzentrationen in einem geeigneten Kalibrierungssatz. Die Linearitätsstudie der 6-Thioguanin-Chromatographiemethode wurde an Blut durchgeführt, das mit Testsubstanzen im Bereich der therapeutischen Konzentration von 6-TG (100–450 pmol/8 × 108 RBC) angereichert war, gemäß den CLSI-Richtlinien38. Die 6-Thioguanin-Spiegel schwankten jedoch erheblich, und der Bereich der Methode wurde von 479 auf 17.118 ng/ml (48 pmol/8 × 108 Erythrozyten bzw. 1650 pmol/8 × 108 Erythrozyten) erweitert und validiert. Bei der Umrechnung des Konzentrationsbereichs in pmol/8 × 108 Erythrozyten in ng/ml sollte die Molmasse von 6-Thioguanin berücksichtigt werden. Umrechnen von pmol in ng: Teilen Sie den Konzentrationsbereich in pmol/8 × 108 Erythrozyten durch die Anzahl der roten Blutkörperchen (8 × 108), um die Konzentration in pmol/Erythrozyten zu erhalten. Die Konzentration in pmol/RBC wurde dann mit der Molmasse von 6-Thioguanin multipliziert, um sie in ng/RBC umzurechnen. Konvertieren Sie ng/RBC in ng/ml: Die Konzentration in ng/RBC wurde durch das für die Analyse verwendete Blutvolumen (ml) geteilt und die Ergebnisse wurden an die Anzahl der roten Blutkörperchen (RBC) des Patienten angepasst.

Zu diesem Zweck wird eine Reihe von Arbeitskalibrierlösungen aus dem 6-TG-Standard in einer Konzentration von 10 mg/mL unter Zugabe einer genau bekannten und gleichen Menge eines internen Standards (Konzentration des IS-Standards in einer Lösung von 100) hergestellt µg/ml) analysiert. Für jede Konzentrationsstufe wurden unabhängig voneinander vier Kalibrierungslösungen hergestellt und auf das chromatographische System dosiert. Der Mindestbereich sollte Analytkonzentrationen von 50 (LLOQ, untere Quantifizierungsgrenze) bis 150 % (ULOQ, obere Quantifizierungsgrenze) abdecken.

Die Nachweisgrenzen (LOD) wurden anhand der folgenden mathematischen Beziehung bestimmt: LOD = (3,3 × SD)/a. Für die Quantifizierung (LOQ) sah es hingegen wie folgt aus: LOQ = (10 × SD)/a. SD steht für die Standardabweichung der Regressionsgeraden und a ist der Richtungskoeffizient einer Kalibrierungskurve.

Die Genauigkeit einer Analysemethode (Bias) ist die Nähe der mit einer bestimmten Methode erzielten durchschnittlichen Ergebnisse zur tatsächlichen Konzentration des Analyten in der Probe. Sie wird anhand von Analysen von Proben ermittelt, die genau bekannte Konzentrationen des Analyten enthalten, sowie Analysen von sogenannten Kontrollproben. Faktoren, die die Genauigkeit einer bestimmten Methode beeinflussen, sind die Komponenten sowohl systematischer als auch zufälliger Fehler. Die Richtigkeit, der Grad der Übereinstimmung zwischen dem traditionellen Wert und dem experimentellen Mittelwert, wird als prozentuale Abweichung vom akzeptierten Referenzwert (Bias)37 gemessen. Zur statistischen Auswertung wurde der Student-t-Test verwendet. Das Akzeptanzkriterium für biologische Proben: Der Mittelwert der Ergebnisse sollte nicht mehr als 15 % (20 % für LLOQ) vom Nominalwert abweichen.

Präzision ist der Grad der Streuung zwischen Messungen einer Reihe mehrerer Proben derselben homogenen Probe unter denselben experimentellen Bedingungen. Wird normalerweise als Ungenauigkeit ausgedrückt und als relative Standardabweichung (RSD, CV) angegeben. Präzision kann Wiederholgenauigkeit oder Zwischengenauigkeit sein. Das Papier definiert Wiederholbarkeit und Zwischengenauigkeit.

Wiederholbarkeit bedeutet Genauigkeit unter bestimmten Betriebsbedingungen über einen kurzen Zeitraum (normalerweise innerhalb eines Tages nach der Analyse). Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu bestimmen, wurden Vollblutproben verwendet, die mit verschiedenen Mengen 6-TG angereichert waren und genau bekannte Konzentrationen beider Verbindungen und des internen Standards enthielten. Zu diesem Zweck wurden fünf Kontrollproben Vollblut, die die Testsubstanz nicht enthielten, mit 6-TG in drei Konzentrationsstufen (750 ng/ml, 4389 ng/ml und 12.450 ng/ml) angereichert und einer dreifachchromatographischen Analyse unterzogen.

Zwischenpräzisionsstudien wurden zwei Tage lang an fünf verschiedenen Vollblutproben durchgeführt, die wie zuvor mit drei Konzentrationsniveaus angereichert waren, darunter niedrige, mittlere und hohe Konzentrationen von 6-TG im Vollblut, und einer dreifachen chromatographischen Analyse unterzogen . Die Analysen wurden von verschiedenen Analysten mit unterschiedlichen Standardlösungen durchgeführt. Die mittlere Präzision der Analyse von 6-TG in Vollblut bei drei Konzentrationsniveaus wird durch den Variationskoeffizienten (CV) ausgedrückt.

Die Extraktionswiederfindung wurde als Prozentsatz der Analytreaktion nach der Probenvorbereitung im Vergleich zur Reaktion des in der Standardlösung vorhandenen Analyten bei bekannter Konzentration bestimmt. Die Extraktionsrückgewinnung der 6-TG-Extraktion aus Serumproben wurde bei drei Analytkonzentrationsniveaus, 750 ng/ml, 4389 ng/ml und 12.450 ng/ml, relativ zu einer wässrigen Lösung einer Mischung aus 6-TG und IS bestimmt.

Unter Verschleppung versteht man die Kontamination der zu analysierenden Probe mit einer Substanz, die nach der vorherigen Analyse in der Schleife des Autosamplers vorhanden war. Diese Tests werden mit zwei abwechselnd dosierten Lösungen durchgeführt. Bei der ersten handelt es sich um die Kalibrierlösung mit der höchsten Konzentration der Testsubstanz, bei der zweiten um eine Blindprobe, die weder die Testsubstanz noch den internen Standard enthält. Das Fehlen von Peaks im Chromatogramm der Blindprobe weist auf einen fehlenden Transfer hin.

Unter Stabilität versteht man die chemische Stabilität des Analyten in jeder Matrix unter bestimmten Bedingungen für bestimmte Zeitintervalle37. Die Stabilität von Vollblutproben, die mit 6-TG-Konzentrationen von 650 ng/ml und 8906 ng/ml mit dem internen Standard (IS) angereichert waren, wurde getestet, angemessen vorbereitet und 24 Stunden lang im Autosampler bei 5 °C gelagert. Bei der Stabilitätsanalyse wurde die Detektorreaktion verglichen, die für die 6-TG- und IS-Peaks in der Probe erhalten wurde, die dem verifizierten Parameter ausgesetzt war. Das Akzeptanzkriterium war die für die getesteten Lösungen ermittelte Wiederfindung gegenüber der frisch zubereiteten Lösung im oben angegebenen Bereich bei den Wiederfindungstests.

Diese Studie folgte den Richtlinien des Polnischen Rates der medizinischen Forschungsagenturen. Wir beziehen menschliche Freiwillige gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki ein. Allen Teilnehmern war der Forschungszweck bekannt. Die Einverständniserklärung aller Teilnehmer bzw. der Erziehungsberechtigten der Teilnehmer wurde eingeholt. Die Methodik wurde für kommerzielle Analysen entwickelt, die in einem zertifizierten Diagnoselabor durchgeführt werden. Weder das polnische Akkreditierungszentrum (PN-EN ISO 15189) noch die Nationale Kammer der Labordiagnostiker weisen auf die Notwendigkeit hin, die Zustimmung der Bioethikkommission einzuholen. Im Allgemeinen sind Blut und seine Fraktionen sowie Urin die am häufigsten verwendeten Materialien für Routinebestimmungen in dieser Art von Laboreinheit. Die polnische Gesetzgebung (Gesetz über klinische Prüfungen von Humanarzneimitteln vom 13.01.2023) besagt, dass in diesem Fall keine Ethikgenehmigung erforderlich ist.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Petit, E. et al. Unterschiedliche toxische Wirkungen von Azathioprin, 6-Mercaptopurin und 6-Thioguanin auf menschliche Hepatozyten. Toxicol. In Vitro 22, 632–642 (2008).